4  Процессинг антигенов для MHC I

Процессинг антигенов для непосредственного МНС первого класса проходит в 6 стадий[1]:

1. Получение антигена (фагоцитозом, пиноцитозом и прочими способами)
2. Присоединение метки к белку в цитоплазме,
3. Гидролиз меченого белка протеасомой на отдельные пептиды,
4. Транспорт пептидов в ЭПР,
5. Встраивание пептида в белок МНС первого класса,
6. Транспорт комплекса на ЦПМ.

В качестве метки используется особый небольшой консервативный белок - убиквитин. Мечение осуществляется специальной убиквитин-протеосомальной системой (Ubiquitin-proteasomal system, UPS). Каскад реакций мечения описан в этой работе[2]. Сначала 1 молекула убиквитина ковалентно присоединяется к остатку цистеина убиквитин-активирующего фермента своим С-концевым остатком с затратой АТФ, затем он пересносится на убиквитин-конъюгирующий фермент. Следующим этапом убиквитин-конъюгирующий фермент формирует комплекс с убиквитинлигазой, с которой связан некоторый белковый субстрат. Убиквитинлигаза катализирует реакцию ковалентного связывания остатка лизина субстрата с С-концевым остатком глицина молекулы убиквитина. Дальнейший рост метки осуществялется убиквитинлигазой. Метка состоит из 4 молекул убиквитина, соедининенных между собой ковалентной связью между лизинами в 48 положении одной молекулы и С-концевым остатком глицина другой[3].

Меченые белки поступают в особый белковый комплекс - протеасому. Существует множество типов протеосом, в зависимости от комбинации составляющих её частей[4]. Стандартная человеческая 26S протеасома состоит из 3 частей: активной зоны - 20S “бочонка”, который состоит из 28 субъединиц, которые организованы в стопку из 4 колец: 2 \(\beta\)-кольца в центре и 2 \(\alpha\)-кольца по краям, - и 2 регуляторных 19S частей, решулирующие доступ внутрь каталитической области, распознающие меченый субстрат[5]. Каталитическими являются лишь 1, 2 и 5 субъединицы \(\beta\)-колец. Разные субъединицы обладают разным типом химической активности, но нет определенных правил, позволяющих сказать по какому аминокислотному остатку точно произойдет расщепление в определенной последовательности. Характеристика каталитических субъединиц приведена в Table 4.1. Существуют специальные каталитические субъединицы, которые экспрессируются при наличии IFN-\(\gamma\), и они обладают несколько другим профилем активности, чем стандартные каталитические субъединицы. Кроме этого, есть специальная пятая субъединица, которая экспрессируется только в кортикальном слое тимуса эпителиальными клетками. По типу входящих в активную зону каталитических субъединиц выделяют конститутивные протеасомы, иммунопротеосомы и тимопротеосомы. Конститутивные протеасомы - те протеасомы, в состав которых входят только конститутивные субъединицы \(\beta1\), \(\beta2\) и \(\beta5\). Иммунопротеосомами называют протеосому, в которой есть \(\beta1i\), \(\beta2i\) и \(\beta5i\) субъединицы[6]. Тимопротеосомой же называют специфичный для эпителиальных клеток кортикального слоя тимуса белковый комплекс, в состав которого входят \(\beta1i\), \(\beta2i\) и \(\beta5t\) субъедиинцы[7]. Также существуют промежуточные формы иммунопротеосом, в которых произошла неполная замена конститутивных субъединиц на индуцированные.

Table 4.1: Характеристика каталитических субъединиц протеосом. Суффикс i означает индуцированный, суффикс t - тимус-специфичный. Каспазо-подобная активность означает, что гидролиз пептидной связи предпочтителен после кислотных остатков аспартата и глутамат, трипсин-подобная активность - после основных остатков лизина и аргинина, химотрипсин-подобная - после гидрофобных остатков лейцина, триптофана, тирозина и фенилаланина.

Субъединица	Общепринятое имя	Альтернативное имя	Ген	Предпочтительная активность
Бета тип-6	\(\beta1\)	Y, Delta, LMP19, Pre3	PSMB6	Каспазо-подобная
Бета тип-9	\(\beta1i\)	Lmp2, RING12, MC7	PSMB9	Химотрипсин-подобная
Бета тип-7	\(\beta2\)	Z, MC14, Lmp9, Pup1	PSMB7	Трипсин-подобная
Бета тип-10	\(\beta2i\)	MECL-1, Lmp10	PSMB10	Трипсин-подобная
Бета тип-5	\(\beta5\)	X, epsilon, Lmp17, MB1, Pre2, Doa3, Prg1	PSMB5	Химотрипсин-подобная
Бета тип-8	\(\beta5i\)	Lmp7, RING10, Y2, C13	PSMB8	Химотрипсин-подобная
Бета тип-11	\(\beta5t\)	Thymus-specific β5	PSMB11	Химотрипсин-подобная

Анализ субстратной специфичности показывает, что конститутивная протеосома предпочитает выпускать пептиды с гидрофобными или основными остатками на С-конце, но это не означает, что не бывает других аминокислот на С-конце, к тому же у протеосом нет особых предпочтениям по другим позициям в итоговом пептиде, а наблюдаемые частоты аминокислотных остатков зависят от строения регуляторных и каталитических субъединиц используемой протеосомы[8]. Индуцированные субъединицы обладают отличающимся профилем каталитической активности: \(\beta1i\) субъединица предпочитает гидрофобные остатки с разветвленной цепью, в отличие от \(\beta1\), предпочитающей кислотные остатки, \(\beta5i\) обладает ещё большим сродством к гидрофобным остаткам, чем \(\beta5\), а профиль активности \(\beta2\) и \(\beta2i\) идентичен[9]. \(\beta5t\) субъединица обладает пониженной химотрипсин-подобной активностью без влияния на каспазо-подобную и трипсин-подобную активности, что увеличивает долю пептидов с кислотным С-концевым остатком[10]. Тимопротеосома участвует в положительной селекции CD8⁺-лимфоцитов[11]. Для положительной селекции лифоцитов важно, чтобы они распознали комплекс “свой пептид-МНС”, поэтому тимопротеосома генерирует пептиды более похожие на собственные, в то время, как для иммунопротеосомы важно генерировать пептиды максимально непохожие на собственные для скорейшей реализации иммунного ответа.

С помощью UPS клетка избавляется как от поврежденных или ненужных белков, так и от дефективных рибосомальных продуктов (defective ribosomal products, DRiP). DRiP представляют из себя пептиды, транслированные с интронов на неправильно сплайсированных мРНК, транслированные с сдвигом рамки считывания и неправильно уложенные белки, меченные убиквитином для их быстрого разрушения протеосомой[3]. Нарушения утилизации DRiP могут приводить к различным заболеваниям[12]. DRiP также служат важным источником антигенных пептидов для презентирования на МНС I[13].

В цитоплазме с продуктами гидролиза белков протеосомой могут произойти следующие события: утрата пост-трансляционных модификаций и пептидный сплайсинг, катализируемый протеосомой (proteosome-catalyzed peptide splicing, PCPS), дальнейший гидролиз с N-конца цитозольными протеазами. Например, гликопротеины теряют N-связанные гликаны[14]. Эта реакция конвертирует остаток аспарагина в остаток аспартата, что важно для распознания некоторых опухолевых антигенов[15]. PCPS впервые наблюдали при анализе антигенов рака почки[16]. Несмотря на то, что некоторые ученые сомневаются в существовании этого явления[17], оно наблюдается и изучается разными коллективами учёных[18–22], и большая часть иммунопептидома, который презентируется на HLA I класса, до 35% в некоторых клеточных линиях, может быть представлен сплайсированными пептидами[23]. PCPS - процесс соедининия двух пептидов, продуцированных протеосомой. Она же и катилизирует реакцию сплайсинга. Механизм реакции заключается в атаке свободной аминогруппой одного пептида ацил-ферментного интермедиата[24]. Присоединение возможно в трех вариантах в зависимости от происхождения пептидов и порядка присоединения. Когда два пептида происходят из одного белка, говорят о цис-сплайсинге, если из двух разных белков, то о транс-сплайсинге. При цис-сплайсинге возможно два варианта. В первом случае пептиды присоединяются в том же порядке, как они идут в исходной последовательности, во втором случае же в обратном: пептид, который был ближе к С-концу исходного белка формирует N-конец сплайсированного пептида.

После выхода из протеосомы, пептиды достаточно длииные, чтобы не помещаться в пептидсвязывающую бороздку, могут дальше разрушаться с N-конца цитозольными протеазами. Есть убедительные доказательства, что после выхода из протеосомы, процессинг с С-конца не происходит в клетках[25; 26]. Показано, что участие в дальнейшем укорочении пептидов могут принимать участие пуромицин-чувствительная аминопептидаза, блеомуцингидролаза, анти-трипептидилпептидаза II [27; 28]. От полного разрушения пептиды защищены шаперонами, например, кольцевым комплексом (TCP-1 ring complex, TRiC)[29].

Далее пептиды подлежат транспорту в ЭР, где должно произойти их встраивание в МНС I. Их транслокацию обеспечивают специальные транспортеры, ассоциированные с антигенным процессингом (transporters associated with antigen processing, TAP). Это два белка, ТАР-1 и ТАР-2, из семейства АТФ-связывающих кассет (ATP-binding cassette, ABC), состоящие из N-концевого трансмембраного домена и С-концевого нуклеотид-связывающего домена[30]. Гомодимеры этих белков не имеют функциональной активности[31]. Между трансмембранным доменом TAP-белков и белком тапасином есть солевой мостик, который важен для сборки пептид-загружающего комплекса (peptide-loading complex, PLC)[32]. Пептид связывается с транспортером, когда он в релаксированном состоянии, и иницирует в нем конформационные перестройки, в результате которых попадает в полость ЭР[33]. Гидролиз АТФ возвращает транспортер в исходное состояние[34]. Пептиды не покидают ЭР через TAP-транспортеры, так как их высокая концентрация в полости ЭР вызывает транс-ингибирование комплекса[35]. Только один пептид в один момент времени связывается с ТАР-комплексом[36]. Оптимальная длина пептида для переноса 8-16 аминокислот, хотя ТАР-1/2 способен переносить пептиды до 40 аминокислот[37; 38]. Важными для связывания с транспортером являются первые три N-концевые и одна С-концевая аминокислота[39]. Есть некоторые предпочтения по якорным остаткам у ТАР-транспортеров, а между ними участки могут сильно отличаться по длине и физико-химическим свойствам[33]. В позиции 1 и 2 N-конца предпочтительны положительно заряженные аминокислоты, в позиции 3 предпочтительны ароматические аминокислоты, в первых трех позициях не должно быть пролина, гиброфобные или основные аминокислоты на С-конце[3; 40; 41].

После попадания пептида в ЭР он сразу поступает в PLC. PLC состоит из собраной молекулы HLA I, шаперона кальретикулина, ТАР-ассоциированного белка тапасина и тиоловой редуктазы ERp57[42]. Этот комплекс ответственен за присоединение эпитопа к молекуле HLA. Комплекс не загружает в молекулу HLA первый попавшийся пептид, а подбирает наиболее аффиный, удаляя низкоафииные. Этот процесс называется пептидным корректированием[3]. Кроме этого, в полости ЭР есть специальные аминопептидазы, ассоциированные с антигенным процессингом (endoplasmatic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing, ERAAP). Это два фермента, ERAP1 и ERAP2, которые представляют из цинковые протеазы с консервативным мотивом His-Glu-X-X-His-X18-Glu, которые также нарезают пептиды с N-конца[43]. Экспрессия этих ферментов увеличивается под действием IFN-\(\gamma\)[43]. Здоровые клетки с нокаутом этих генов продуцируют неиммунногенные пептиды или пептиды, которые вызывают гибель клетки из-за действия на них цитотоксических Т-лимфоцитов[44]. Пептиды, которым не удалось связаться с MHC удаляются из ЭР с помощью АТФ-зависимого транспортера Sec61[45].

Следует иметь в виду, что процессинг антигена не совсем последовательный процесс. Например, получение эпитопа IYMDGTADSFSF из фермента тирозиназы проходит следующие стадии[18]:

1. После синтеза белок попадает в ЭР, где происходит N-гликозилирование по специфичным аспарагиновым остаткам;

2. После этого белок переносится в цитоплазму, но некоторые молекулы из них неправильно собираются, поэтому идут на утилизацию в UPS;

3. У неправильно собранных белков произходит потеря N-связанных гликанов с конверсией аспарагина в аспартат;

4. В протеосоме два пептида с такими конвертированными сайтами, IYMDGT и ADSFSF, соединияются (цис-прямой сплайсинг, катализированный протеосомой);

5. Пептид IYMDGTADSFSF переносится в ЭР, загружается в молекулу MHC и полученный комплекс транспортируется на ЦПМ.

1. Pishesha N. A guide to antigen processing and presentation / N. Pishesha, T.J. Harmand, H.L. Ploegh // Nature Reviews Immunology. – 2022. – Vol. 22. – № 12. – P. 751-764.

2. Gong B. The ubiquitin-proteasome system: Potential therapeutic targets for alzheimer’s disease and spinal cord injury / B. Gong [et al.] // Frontiers in Molecular Neuroscience. – 2016. – Vol. 9. – The ubiquitin-proteasome system.

3. Мерфи К. Иммунобиология по Джанвею / К. Мерфи, К. Уивер. – 9. – Москва: Логосфера, 2020.

4. Tanaka K. The proteasome: Overview of structure and functions / K. Tanaka // Proceedings of the Japan Academy, Series B. – 2009. – Vol. 85. – The proteasome. – № 1. – P. 12-36.

5. Kloetzel P.-M. Antigen processing by the proteasome / P.-M. Kloetzel // Nature Reviews Molecular Cell Biology. – 2001. – Vol. 2. – № 3. – P. 179-188.

6. Murata S. The immunoproteasome and thymoproteasome: functions, evolution and human disease / S. Murata [et al.] // Nature Immunology. – 2018. – Vol. 19. – The immunoproteasome and thymoproteasome. – № 9. – P. 923-931.

7. Murata S. Regulation of CD8 ⁺ T Cell Development by Thymus-Specific Proteasomes / S. Murata [et al.] // Science. – 2007. – Vol. 316. – № 5829. – P. 1349-1353.

8. Harris J.L. Substrate speci¢city of the human proteasome / J.L. Harris [et al.]. – P. 11.

9. Murata S. The immunoproteasome and thymoproteasome: functions, evolution and human disease / S. Murata [et al.] // Nature Immunology. – 2018. – Vol. 19. – The immunoproteasome and thymoproteasome. – № 9. – P. 923-931.

10. Takahama Y. β5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8+ T cells / Y. Takahama [et al.] // Current Opinion in Immunology. – 2012. – Vol. 24. – β5t-containing thymoproteasome. – № 1. – P. 92-98.

11. Kniepert A. The unique functions of tissue-specific proteasomes / A. Kniepert, M. Groettrup // Trends in Biochemical Sciences. – 2014. – Vol. 39. – № 1. – P. 17-24.

12. Mediani L. Defective ribosomal products challenge nuclear function by impairing nuclear condensate dynamics and immobilizing ubiquitin / L. Mediani [et al.] // The EMBO Journal. – 2019. – Vol. 38. – № 15.

13. Dolan B.P. Defective Ribosomal Products Are the Major Source of Antigenic Peptides Endogenously Generated from Influenza A Virus Neuraminidase / B.P. Dolan [et al.] // The Journal of Immunology. – 2010. – Vol. 184. – № 3. – P. 1419-1424.

14. Suzuki T. The cytoplasmic peptide:N-glycanase (NGLY1) Structure, expression and cellular functions / T. Suzuki, C. Huang, H. Fujihira // Gene. – 2016. – Vol. 577. – The cytoplasmic peptide. – № 1. – P. 1-7.

15. Kasteren S.I. van. Chemical biology of antigen presentation by MHC molecules / S.I. van Kasteren [et al.] // Current Opinion in Immunology. – 2014. – Vol. 26. – P. 21-31.

16. Hanada K. Immune recognition of a human renal cancer antigen through post-translational protein splicing / K. Hanada, J.W. Yewdell, J.C. Yang // Nature. – 2004. – Vol. 427. – № 6971. – P. 252-256.

17. Admon A. Are There Indeed Spliced Peptides in the Immunopeptidome? / A. Admon // Molecular & Cellular Proteomics. – 2021. – Vol. 20. – P. 100099.

18. Vigneron N. Peptide splicing by the proteasome / N. Vigneron [et al.] // Journal of Biological Chemistry. – 2017. – Vol. 292. – № 51. – P. 21170-21179.

19. Mansurkhodzhaev A. Proteasome-Generated cis-Spliced Peptides and Their Potential Role in CD8+ T Cell Tolerance / A. Mansurkhodzhaev [et al.] // Frontiers in Immunology. – 2021. – Vol. 12. – P. 614276.

20. Mishto M. An in silicoin vitro Pipeline Identifying an HLA-A*02:01+ KRAS G12V+ Spliced Epitope Candidate for a Broad Tumor-Immune Response in Cancer Patients / M. Mishto [et al.] // Frontiers in Immunology. – 2019. – Vol. 10. – An in silicoin vitro Pipeline Identifying an HLA-A*02. – P. 2572.

21. Kato K. Characterization of Proteasome-Generated Spliced Peptides Detected by Mass Spectrometry / K. Kato [et al.] // The Journal of Immunology. – 2022. – Vol. 208. – № 12. – P. 2856-2865.

22. Lichti C.F. Navigating Critical Challenges Associated with Immunopeptidomics-Based Detection of Proteasomal Spliced Peptide Candidates / C.F. Lichti [et al.] // Cancer Immunology Research. – 2022. – Vol. 10. – № 3. – P. 275-284.

23. Liepe J. A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides / J. Liepe [et al.] // Science. – 2016. – Vol. 354. – № 6310. – P. 354-358.

24. Vigneron N. Production of spliced peptides by the proteasome / N. Vigneron [et al.] // Molecular Immunology. – 2019. – Vol. 113. – P. 93-102.

25. Rock K.L. Protein degradation and the generation of MHC class I-presented peptides / K.L. Rock [et al.] // DOI: 10.1016/S0065-2776(02)80012-8. – Elsevier, 2002. – Vol. 80. – P. 1-70.

26. Craiu A. Two distinct proteolytic processes in the generation of a major histocompatibility complex class I-presented peptide / A. Craiu [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1997. – Vol. 94. – № 20. – P. 10850-10855.

27. Stoltze L. Two new proteases in the MHC class I processing pathway / L. Stoltze [et al.] // Nature Immunology. – 2000. – Vol. 1. – № 5. – P. 413-418.

28. Rock K.L. Proteases in MHC Class I Presentation and Cross-Presentation / K.L. Rock, D.J. Farfán-Arribas, L. Shen // The Journal of Immunology. – 2010. – Vol. 184. – № 1. – P. 9-15.

29. Kunisawa J. The Group II Chaperonin TRiC Protects Proteolytic Intermediates from Degradation in the MHC Class I Antigen Processing Pathway / J. Kunisawa, N. Shastri // Molecular Cell. – 2003. – Vol. 12. – № 3. – P. 565-576.

30. Daumke O. Functional asymmetry of the ATP-binding-cassettes of the ABC transporter TAP is determined by intrinsic properties of the nucleotide binding domains: Modular function of TAP domains / O. Daumke, M.R. Knittler // European Journal of Biochemistry. – 2001. – Vol. 268. – Functional asymmetry of the ATP-binding-cassettes of the ABC transporter TAP is determined by intrinsic properties of the nucleotide binding domains. – № 17. – P. 4776-4786.

31. Urlinger S. Intracellular Location, Complex Formation, and Function of the Transporter Associated with Antigen Processing in Yeast / S. Urlinger [et al.] // European Journal of Biochemistry. – 1997. – Vol. 245. – № 2. – P. 266-272.

32. Blees A. Assembly of the MHC I peptide-loading complex determined by a conserved ionic lock-switch / A. Blees [et al.] // Scientific Reports. – 2015. – Vol. 5. – № 1. – P. 17341.

33. Lehnert E. Structure and Dynamics of Antigenic Peptides in Complex with TAP / E. Lehnert, R. Tampé // Frontiers in Immunology. – 2017. – Vol. 8.

34. Abele R. The ABCs of Immunology: Structure and Function of TAP, the Transporter Associated with Antigen Processing / R. Abele, R. Tampé // Physiology. – 2004. – Vol. 19. – The ABCs of Immunology. – № 4. – P. 216-224.

35. Grossmann N. Mechanistic determinants of the directionality and energetics of active export by a heterodimeric ABC transporter / N. Grossmann [et al.] // Nature Communications. – 2014. – Vol. 5. – № 1. – P. 5419.

36. Herget M. Purification and Reconstitution of the Antigen Transport Complex TAP / M. Herget [et al.] // Journal of Biological Chemistry. – 2009. – Vol. 284. – № 49. – P. 33740-33749.

37. Endert P.M. van. A sequential model for peptide binding and transport by the transporters associated with antigen processing / P.M. van Endert [et al.] // Immunity. – 1994. – Vol. 1. – № 6. – P. 491-500.

38. Gorbulev S. Allosteric crosstalk between peptide-binding, transport, and ATP hydrolysis of the ABC transporter TAP / S. Gorbulev, R. Abele, R. Tampé // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2001. – Vol. 98. – № 7. – P. 3732-3737.

39. Herget M. Conformation of peptides bound to the transporter associated with antigen processing (TAP) / M. Herget [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2011. – Vol. 108. – № 4. – P. 1349-1354.

40. Androlewicz M.J. Human transporters associated with antigen processing possess a promiscuous peptide-binding site / M.J. Androlewicz, P. Cresswell // Immunity. – 1994. – Vol. 1. – № 1. – P. 7-14.

41. Uebel S. Recognition principle of the TAP transporter disclosed by combinatorial peptide libraries / S. Uebel [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1997. – Vol. 94. – № 17. – P. 8976-8981.

42. Blees A. Structure of the human MHC-I peptide-loading complex / A. Blees [et al.] // Nature. – 2017. – Vol. 551. – № 7681. – P. 525-528.

43. Serwold T. ERAAP customizes peptides for MHC class I molecules in the endoplasmic reticulum / T. Serwold [et al.] // Nature. – 2002. – Vol. 419. – № 6906. – P. 480-483.

44. Yewdell J.W. Don’t mess with ERAAP! / J.W. Yewdell, X. Lu // Nature Immunology. – 2012. – Vol. 13. – № 6. – P. 526-528.

45. Osborne A.R. PROTEIN TRANSLOCATION BY THE SEC61/SECY CHANNEL / A.R. Osborne, T.A. Rapoport, B. van den Berg // Annual Review of Cell and Developmental Biology. – 2005. – Vol. 21. – № 1. – P. 529-550.